مقدمه:

اثر رامان برای اويل بار توسط کريشنن و رامان گزارش شد. علاوه بر کشف اثر، رامان در زمينه ی پراکندگی اشعه ايکس، اپتيک و محلول های کلوييدی تحقيق کرد. رامان در سال ۱۹۳۰ برنده ی جايزه ی نوبل شد.رامان تکنيکی است که به کمک تابش پراکنده شده از برخورد فوتون با مولکول، خواص مولکول را آشکار می کند.

در این ازمایش وقتی نور به نمونه تابيده می شود، آن را برا انگيخته کرد و به نوسان و حرکت وا می دارد. همين نوسان هاست که اندازه گيری می شود.برهمکنش رامان دو خروجی ممکن دارد: اگر ماده انرژی جذب کند و فوتون تابش شده انرژی پايين تری از فوتون اوليه داشته باشد . اين پراکندگی ِ رامان استوکس نام دارد. اگر انرژی بالاتری داشته باشد، رامان آنتی-استوکس است. طيف رامان: طيف فوتون های پراکنده شده را طيف رامان می گويند. اين طيف شدت نور پراکنده را به صورت تابعی از اختلاف فرکانس Δν با فوتون فرودی نشان می دهد. اين اختلاف به جابجايی رامان معروف است.

 

طیف سنجی رامان

طیف سنجی رامان مطالعه نوعی از برهمکنش بین نور و ماده است که در آن نور دچار پراکندگی غیرالاستیک می‌شود. در آزمایشهای طیف سنجی رامان، فوتونهای تک طول موج (در ناحیه‌ی مرئی، نور تکفام گفته می‌شود) روی نمونه متمرکز می‌شود و عموماً لیزر به عنوان چشمه تکفام شدت بالا بکار می‌رود. فوتونها با مولکول‌ها برهمکنش می‌کنند و بازتابیده، جذب یا پراکنده می‌شوند. طیف سنجی رامان فوتونهای پراکنده شده را مطالعه می‌کند. غالباً فوتونهایی که با مولکولها برهمکنش می‌کنند، به طور الاستیک پراکنده می‌شوند.به این نوع پراکندگی، پراکندگی ریلی گفته می‌شود و فوتونهای پراکنده شده همان طول موج نور فرودی را دارند. اما تقریباً از هر یک میلیون فوتون، یک فوتون به طور غیرالاستیک پراکنده می‌شود. در پراکندگی رامان، فوتون فرودی با ماده برهمکنش می‌کند و طول موج آن به سمت طول موج‌های بیشتر یا کمتر شیفت می‌یابد. شیفت به طول موجهای بیشتر غالب است و این پراکندگی را رامان استوکس می‌گویند. اتفاقی که در اینجا می‌افتد آن است که فوتون با ابر الکترونی پیوندهای گروههای عاملی برهمکنش می‌کند و الکترون را به یک حالت مجازی برانگیخته می‌کند. سپس الکترون از حالت مجازی به یک حالت ارتعاشی یا چرخشی برانگیخته واهلش می‌یابد. این باعث می شود که فوتون مقداری از انرژی خود را از دست بدهد و به صورت پراکندگی رامان استوکس آشکارسازی شود. انرژی از دست داده شده ارتباط مستقیمی با گروه عاملی، ساختار مولکولی متصل به آن، نوع اتمهای مولکول و محیط آن دارد. طیفهای رامان هر مولکول، منحصربه‌فرد است. از این رو می‌توان از آن مانند "اثر انگشت" در تشخیص ترکیبات مولکولی روی یک سطح، درون یک مایع یا در هوا استفاده کرد.

 

اصول طیف بینی رامان

     طیف رامان از تابش دهی یک نمونه با یک منبع لیزر قوی با تابش تک فام (monochromatic) در ناحیه مرئی یا مادون قرمز نزدیک  به دست می آید. منشا فیزیکی پراکندگی (Scattering) رامان در برخوردهای غیرالاستیک بین مولکول ها و فوتون های تشکیل دهنده پرتو نوری ست.

    وقتی نور با مولکول برخورد می کند، میدان الکتریکی نور به همه الکترون های مولکول نیرو وارد می کند و آنها را جابجا می کند. این جابجایی سبب ایجاد یک ممان دوقطبی القایی در مولکول می شود. به عبارت دیگر برهم کنش بین فوتون و مولکول موجب ایجاد یک حالت واسطه با طول عمر بسیار کوتاه خواهد شد که در آن ساختار هندسی مولکول تغییر نکرده و تنها ابر الکترونی آن متحمل یک واپیچش (distortion) یا ز (polarization) می شود.

شکل حقیقی ابر الکترونی تغییر حالت یافته، به میزان انرژی دریافت شده توسط مولکول بستگی دارد. اندازه ممان دوقطبی القایی با قطبش پذیری (polarizability)  و شدت میدان الکتریکی فوتون رابطه مستقیم دارد. در نتیجه برخورد غیرالاستیک، تبادل انرژی بین مولکول و فوتون صورت می گیرد. این تبادل انرژی به صورت انرژی ارتعاشی یا دورانی به مولکول داده  یا از مولکول گرفته می شود و سبب تغییر طول موج فوتون می شود.

 اگر مولکول انرژی جذب کند و فوتون تابش شده انرژی کمتری از فوتون اولیه داشته باشد و در نتیجه در فرکانس های کمتر و طول موج بلندتری دیده شود، این پراکندگی رامان استوکس (Stokes) نامیده می شود. و اگر مولکول انرژی از دست دهد و فوتون انرژی جذب کند، فوتون تابش شده فرکانس بالاتری از فرکانس منبع داشته و در طول موج های کوتاه تری مشاهده می شود و این پراکندگی رامان آنتی-استوکس (anti-Stokes) نام دارد.

 جابجایی رامان (Raman shift)، شامل استوکس و آنتی-استوکس، مستقل از طول موج منبع نوری است. جابجایی های ایجاد شده در طول موج منبع در اثر پراکندگی رامان در محدوده طیفی مادون قرمز قرار می گیرد. فرکانس های نوری در محدوده مادون قرمز فقط برای انجام انتقالات میان ترازهای ارتعاشی مولکول ها کافی است و از این نظر دو روش IR  و رامان مشابه یکدیگر هستند.

 وقتی برخورد الاستیک باشد، تبادل انرژی بین فوتون و مولکول انجام نشده و پراکندگی نور با فرکانسی برابر با فرکانس تابشی منبع صورت می گیرد که آنرا پراکندگی ریلی (Rayleigh) می نامند. پراکندگی ریلی به وسیله ذراتی ایجاد می شود که اندازه آنها به مراتب کوچک تر از طول موج تابش باشد.

 

 

تئوری طیف سنجی رامان

یکی از روش‌های متداول بیناب نگاری، طیف سنجی رامان است که مدهای چرخشی، ارتعاشی، و دیگر مدهای فرکانسی کوتاه در یک سیستم را مطالعه می‌کند. در جریان این طیف سنجی نور تکفام دچار پراکندگی غیرالاستیک یا همان پراکندگی رامان می‌شود و غالباً از لیزرهای مرئی، فروسرخ و فرابنفش برای تحریک استفاده می‌شود. نور لیزر با جنبش‌های مولکولی، فوتون‌ها و دیگر تحریک پذیرها برهمکنش کرده و در اثر این برهمکنش فوتون‌های بازتابیده دارای تغییر فرکانس به طول موج‌های بالاتر و پایین‌تر هستند. البته باید توجه داشت کسر قابل توجهی از فوتون‌ها بدون تغییر طول موج از سطح نمونه بازتابیده می‌شوند. تغییر فرکانس در این پدیده حاوی اطلاعات بسیار مهمی از جنبش‌های مولکولی در سیستم است. می‌توان عنوان نمود که در طیف سنجی رامان، شدت و طول موج نور پراکنده شده نور لیزری که با یک نمونه در وضعیت گاز، مایع، جامد و یا پلاسما تعامل می‌نماید را اندازه گیری می‌نماید. به بیانی دیگر سیگنال رامان از تعامل نور (فوتون‌ها) با نوسانات فونون‌ها در یک نمونه مورد مطالعه، سرچشمه می‌گیرند. بررسی و تجزیه و تحلیل اطلاعات بدست آمده در طیف سنجی رامان منجر به تعیین ساختار، اندازه گیری کیفی و در مواردی کمی و همچنین مطالعه اثرات بسیاری از پارامترهای مختلف فیزیکی از قبیل دما، فشار، تنش، کرنش و ... بر نوسانات بین اتمی و بین مولکولی (فونون‌ها) می‌گردد. برای مثال طیف‌های رامان بلورها شامل نوارهای طیفی می‌باشد که مرتبط به ارتعاشات داخل یاخته واحد (مدهای داخلی) و ارتعاشات شبکه (مدهای شبکه) می‌باشد. ممکن است تعداد معینی اتم زمانیکه کنار یکدیگر قرار می‌گیرند منجر به یک ساختار خاص گردند که دارای تقارن معینی می‌باشند. همان مجموعه اتمی می‌توانند در شرایط مختلف فیزیکی دارای تقارن متفاوتی باشند. در دو وضعیت فوق بلور منجر به طیف‌های رامان متفاوت می‌گردد. لذا هر گونه تغییری در فاصله بین اتمی و یا بین مولکولی و همچنین محیط بین آنها از قبیل تغییر و جایگزینی اتمها منجر به جابجایی در فرکانس‌های رامان می‌گردد. غالباً نور لیزر به نمونه برخورد می‌کند و نور بازتابیده از سطح نمونه بوسیله یک لنز جمع شده و بوسیله فیبری به آشکارساز مربوطه منتقل می‌شود. طول موج‌های نزدیک به طول موج لیزر که ناشی از برهمکنش الاستیک (پراکندگی ریلی) از سطح نمونه هستند بوسیله یک فیلتر جذب می‌شوند و پرتوهای بازتابیده شده‌ای که دارای تغییر فرکانسی هستند، عبور می‌کنند و به آشکارساز می‌رسند. طول موج‌هایی که دارای تغییر فرکانسی (طول موجی) هستند برای ما حائز اهمیتند که همان سیگنال‌های رامان محسوب می‌شوند. سطح مقطع پراکندگی رامان بسیار کوچک است و سخت ترین مرحله در این روش جدا کردن پرتوهای الاستیک ریلی از پرتوهای  تغییر یافته فرکانسی رامان است. در گذشته از توری‌های هولوگرافیک و مراحل پاشش چندگانه برای حصول درجه بالایی از طرد پرتو لیزر استفاده می شد. در گذشته، فوتومالتی پلیرها، آشکارساز انتخابی برای دستگاه های رامان پاششی بودند که منجر به زمان جمع آوری داده طولانی میشد. با این وجود، دستگاهی مدرن تقریباً بصورت جهانی از نوج یا فیلتر لبه ای notch or edge filters برای طرد پرتو لیزر و از اسپکتروگراف ها چه تکفامساز عبور محوری (AT)، زرنی-ترنر (CT) و یا اسپتروسکوپی تبدیل فوریه و آشکارسازهای CCD استفاده می کنند.

 

طیف سنج

    مانند بیشتر روش های طیف سنجی، دو نوع طیف سنج در رامان مورد استفاده قرار می گیرد و دو وظیفه عمده تفکیک و جدا کردن تابش منبع از تابش ریلی و اندازه گیری و آنالیز سیگنال های نوری جمع آوری شده را بر عهده دارند.

   دسته اول طیف سنج های پاشنده (Dispersive)  هستند که عموما از یک منبع لیزر با طول موج در ناحیه مرئی و آشکار ساز CCD استفاده می کنند. شکل زیر شمای کلی این نوع طیف سنج را نشان می دهد.

 

شکل شمای کلی طیف سنج های پاشنده در دستگاه رامان

   دسته دوم طیف سنج های تبدیل فوریه هستند، نظیر آنچه که در طیف سنجی IR تشریح شد، که از یک تداخل سنج و تبدیل فوریه برای تبدیل سیگنال تداخلی به طیف رامان استفاده می شود. منابع مورد استفاده در دستگاه تبدیل فوریه عمدتا منابع مادون قرمز نزدیک هستند. شکل زیر شمای کلی طیف سنج های تبدیل فوریه در دستگاه رامان را نشان می دهد.

 

شکل شمای کلی طیف سنج های تبدیل فوریه در دستگاه رامان

    به دلیل عدم تداخل مولکول های آب در طیف های رامان استفاده از سل های کوارتزی و شیشه ای امکان  پذیر است  و بنابراین آماده سازی نمونه کمتری نسبت به روش IR دارد.

 

طیف بینی رامان رزونانس

   همان طور که قبلا گفته شد، برانگیختگی در رامان به ترازهای مجازی با عمر بسیار کوتاه صورت می گیرد. استفاده از فرکانسی که احتمال جذب در آن بالاست بر اثر گرمادهی موضعی باریکه لیزری منبع، سبب تجزیه نمونه خواهد شد. چرخاندن نمونه به نحوی که بخش های مختلف نمونه در زمان های مختلف گرم شوند مانع تجزیه شدن نمونه می شود. در نتیجه امکان استفاده از نورهایی که توسط نمونه جذب شده و طیف رامان قوی تری بدست آید، وجود دارد. این اثر را رامان رزونانس گویند و این تکنیک طیف بینی رامان رزونانس ((Resonance Raman (RR) Spectroscopy شناخته می شود.

   اگرچه شدت رامان رزونانس زیاد است اما معمولا فقط در تعداد کمی از مدهای ارتعاشی قابل مشاهده است. بنابراین رامان رزونانس در مقایسه با رامان معمولی طیف ساده تری دارد که افزایش شدت سیگنال ها امکان آنالیز نمونه های با پراکندگی ضعیف را فراهم می کند.

 

طیف بینی رامان افزاش یافته ی سطحی  (SERS)

     رامان افزاش یافته ی سطحی (Surface Enhanced Raman Spectroscopy, SERS) تکنیکی است که در آن طیف رامان برای شناسایی مولکول هایی که بر روی سطح فلزات جذب سطحی شده اند، به کار می رود. مزیت عمده این روش شدت افزایش یافته پیک های رامان است که از درجه 104 تا 1014 می تواند تقویت شود و به همین علت حتی برای شناسایی یک مولکول منفرد و تک هم بکار می رود.

پراکندگی رامان با جذب سطحی آنالیت یا مولکول هدف بر روی یک سو بستری فلزی بطور چشم گیری افزایش می یابد. این اثر در فلز نقره بسیار قوی ست. اگر چه در در فلزات طلا و مس نیز قابل مشاهده است اما در فلزات دیگر ناچیز است. دو مکانیسم عمده برای توجیه این اثر معرفی شده اند: اثر انتقال بار (charge transfer, CT) و اثر میدان الکترومغناطیس (electromagnetic effect, EME). به اثر انتقال بار اثر شیمیایی (chemical effect) نیز گفته می شود.

     در هر دو مکانیسم وجود یک سطح زبر و ناهموار برای افزایش و ارتقاء سیگنال ضروری ست. در مکانیسم اثر میدان مغناطیسی، تشدید پلاسمون سطحی را عامل ارتقا و افزایش سیگنال می دانند. پلاسمون نوسانات جمعی و آزاد الکترون های لایه رسانش فلز از یک ذره به ذره دیگر است. نوسانات الکترون ها مشابه نوسان های ذرات محیط پلاسما ست به همین علت این اثر را پلاسمون نامگذاری کرده اند. وقتی نور یا الکترون پر انرژی به سطح فلز بتابد، نوسانات جذب قوی در ناحیه مرئی نشان می دهند که به آن جذب پلاسمون سطح گفته می شود.

     وجود سطوح تیز و ناهموار برای اثر EME بسیار ضروری ست چون میدان الکتریکی در نزدیکی نوک تیز سطوح به مقدار بسیار زیادی افزایش می یابد. در اثر انتقال بار ارتقاء سیگنال رامان به افزایش میدان مغناطیسی مرتبط نیست. مولکول جذب سطحی شده تحت شرایط ویژه می تواند با سطح فلز برهم کنش کرده و قطبش پذیری مولکول افزایش یابد. در واقع طبق این مکانیسم اوربیتال های مولکول جذب سطحی شده در اثر اتصال به الکترون های لایه رسانش فلز گسترده شده و ماهیت شیمیایی آن تغییر می کند.

     روش SERS روش بسیار حساسی ست که توانایی آنالیز مولکول های منفرد زیستی را نیز داراست. روش SERS مخرب نیست و قدرت تفکیک بسیار بالایی دارد. سیگنال ارتقا یافته به شدت به جنس فلز و نحوه ساخت سوبسترا وابسته است بنابر این آماده سازی نمونه مرحله بسیار تاثیر گذاری ست و به مهارت و ابزارهای ویژه برای تهیه نمونه SERS نیاز است.

     طیف سنجی رامان افزایش یافته نوک (Tip-Enhanced Raman Spectroscopy,TERS) از تکنیک های پیشرفته SERS است که در آن یک پین (Pin) تیز در مقیاس اتمی با فلز فعال SERS مانند طلا پوشانده می شود. TERS بلافاصله در نزدیکی نوک پین اتفاق می افتد که در نتیجه یک سیگنال با قدرت تفکیک در حد اندازه نوک پین یعنی 20-30nm صورت می گیرد.  در واقع این تکنیک یک روش تلفیقی از SERS و رامان-میکروسکوپ نیروی اتمی (Raman-AFM) است.

 

 

کاربرد های اساسی طيف سنجی رامان 

شناسايی ترکيبات داخل نمونه به وسيله ی تطبيق دادن طيف با طيف های مرجع (اثر انگشت) تشخيص ساختار مولکولی سطوح شناسايی ترکيبات غير ارگانيک در جامدات و محلول های آب پوشيده پيدا کردن نا خالصی ها و افزودنی های مولکولی

 

کاربرد های اخير اثر رمان 

دانشمندان دانشگاه استفورد با استفاده از رامان روشی برای تشخيص سرطان بسيار کم خطر تر از روش های ديگر ارائه کردند 

پرتو ليزری که به سطح پوست تابيده می شود می تواند با دقت بالايی ذرات ريز تزريق شده به جريان خون را تشخيص دهند و خود را به سلول های سرطانی برسانند. 

روش PET می تواند توموری به عرض ۵ ميليمتر شامل ميليون های سلول سرطانی را بر دارد. در حالی که عکس برداری رامان قابليت تشخيص چند صد سلول را دارد.

 

کاربرد رامان در آشکارسازی DNA با اسپکتروسکوپی رامان

محققان دانشگاه Strathclyd انگلیس توانستند با اسپکتروسکوپی رامان رشته‌های DNA جفت شده و جدا شده را با اتصال آنها به نانوذرات نقره مشاهده کنند.SERRS (تفرق رزونانسی سطحی تقویت شدة رامان) با اندازه‌گیری اختلاف انرژی نور متفرق شده از نور تابیده شده، نوعی طیف لرزشی از یک ملکول به‌دست می‌دهد. شدت تفرق با جذب ملکول‌های هدف به درون سطح فلزی ناهموار -مانند نانوذرات نقره و یا طلا- افزایش می‌یابد. اگر نانوذرات متراکم شده و مولکول جذب شده دارای یک کروموفور با گذار الکترونیکی منطبق با طول موج برانگیختگی باشد، نتایج بهتری بدست خواهد آمد.

تامسون عضو این تیم تحقیقاتی می‌گوید: «ما می‌خواستیم بدانیم آیا DNA نشان‌دار شدة رنگی می‌تواند برای جمع کردن انتخابی نانوذرات نقره به‌کار رود و آیا عکس‌العملی در برابر SERRS می‌دهد؟».

تیم تحقیقاتی فوق، دو گروه نانوذرات نقره را با یک نوع رنگ پوشش دادند و سپس یک رشته کوتاه DNA را به هر گروه متصل کردند. رشته‌های DNA در هر دو گروه نانوذرات نقره با یکدیگر مکمل نشدند. سپس رشته‌ای از DNA نشاندار را که مکمل یکی از رشته‌های DNA موجود در دو گروه نانوذرات بود وارد کردند DNA نشاندار به رشته DNA در هر دو گروه از نانوذرات چسبید. آنالیز SERRS، افزایشی چشمگیر را در تراکم و شدت طیف رنگی نشان داد. 

برتری رامان بر فروسرخ

اختلالات وارد شده از طرف حلال، سلول ها و روش های آماده سازی نمونه را برطرف می کند. 

مد های نوسانی فروسرخ گريز را آشکار می کند

برتری فروسرخ بر رامان: خطوط رامان بسيار ضعيف اند و خطوط ريلی غالب اند. ستاپ آزمايشی رامان بسيار پر خرج است. در رامان ممکن است به خاطر نور ليزر فلورسانس در نمونه ايجاد شود و طيف را مختل کند. در نتيجه هر دو تکنيک مکمل يکديگر اند.